Western blot基本原理

在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。

Western blot的中文名稱是：蛋白質印跡,也叫免疫印跡（immunoblotting)。是分子生物學中常用的三種印跡技術之一。目前*的該實驗技術的發明人為美國斯坦福大學的喬治·斯塔克（George Stark）。

Western blot——蛋白質印跡

Southern blot——DNA印跡

Northern blot——RNA印跡

Western blot 優點

高分辨率的電泳技術

特異敏感的抗原-抗體反應

1-5ng中等大小的靶蛋白

Western blot應用

目的蛋白的表達特性分析

目的蛋白與其它蛋白的互作

目的蛋白的組織定位

目的蛋白的表達量分析

Western blot 流程

一、蛋白樣品的提取

提取細胞中的蛋白多是利用將細胞裂解、破碎、使蛋白質釋放的原理。其中裂解液應該新鮮制備，加入少量的蛋白酶抑制劑以減少蛋白的降解，并且分裝凍存于-80℃，蛋白酶抑制劑的種類很多，要根據具體情況選擇。

目的：要獲得高豐度、高品質的蛋白質，以滿足后續實驗的需求。

二、蛋白樣品的定量

Western blot作為一項半定量實驗技術，電泳前，必須盡量使各組之間總蛋白量基本一致;

蛋白質總量不足可能妨礙對目的蛋白的鑒定; 蛋白質含量太高則會使帶形扭曲,甚至會影響此電泳方法的分辨力。

目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍法）、Lowry法（Folin-酚試劑法）、BCA法等。

三、蛋白樣品的變性

全部配好分裝，-20℃凍存。

按1:1比例與蛋白質樣品混合，95～100℃加熱5～15min，冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為20-25μl，總蛋白量20～50μg。

SDS：

陰離子去污劑   變性劑

氨基酸側鏈與SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS膠束。

蛋白質-SDS膠束所帶的負電荷大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，消除了不 同分子之間原有的電荷差異。

與強還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質分子線性化。

蛋白質-SDS膠束的特點：

不連續的電泳緩沖體系。

SDS—蛋白質復合物在凝膠電泳時，不再受蛋白質電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質分子量的大小。

SDS聚丙烯酰胺凝膠配制及蛋白分離范圍

灌膠
灌制分離膠 隔絕空氣 灌制濃縮膠  插入梳子                 

四、電泳

加足夠的電泳液后開始準備上樣。（電泳液至少要漫過內測的小玻璃板。）用微量進樣器貼壁吸取樣品（Marker： 5-10ul ；樣本：10 ul ）。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。

采用恒壓的方法：1.恒壓60V，至樣本跑過 濃縮膠；2.將電壓調至120V至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，準備進行進行轉膜。

五、轉膜

凝膠電泳結束后，將凝膠上分離的蛋白條帶通過轉移電泳方式轉印至固相支持物上，常用的固相支持物有NC （硝酸纖維素）膜、尼龍膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。

選擇膜的主要根據有：

1.膜與目的蛋白分子的結合能力（也就是單位面積的膜能結合蛋白的載量）

2.膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大小）

3.不影響后續的顯色檢測（也就是適合用于所選顯色方法，信噪比好）

4.如果后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質譜分析，還要根據不同目的來挑選不同的轉移膜

濕轉系統

轉一張膜需準備濾紙和1張轉印膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。轉膜前，轉印膜以及濾紙均需浸潤在電轉液中活化15-20min（其中PVDF膜需在無水甲醇中活化30min后再浸潤于電轉液中，且濾紙應與膠和膜的大小一致）。

將玻板輕輕撬開，將凝膠剪裁后從玻板上移至電轉液中。從陰極到正極，按照三層濾紙   凝膠 轉印膜 三層濾紙的順序制成“三明治”（濕轉在三明治的兩側各加一層活化過的海綿，同時應注意去除膜、凝膠和濾紙之間的氣泡）。

半干轉移系統

六、轉膜后檢測

轉完后將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白，將膜晾干備用。

將凝膠用考馬斯亮藍染色，觀察凝膠中的蛋白是否*轉至印跡膜上。

七、封閉，結合一抗，結合二抗。

封閉

為避免作為檢測試劑的特異性抗體與膜發生非特異性結合，使非特異性背景提高，需對膜上的潛在結合位點進行封閉處理。

5%脫脂奶粉或BSA（室溫孵育1h）

Tween-20的作用：減少非特異性吸附，不影響抗體與抗原的結合。

一抗孵育

把膜放在密閉塑料袋或者培養皿中，根據膜面積以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動，于室溫孵育1-2小時或4℃過夜。

回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。

二抗孵育

加入二抗，搖床上緩慢搖動，于室溫孵育1-2小時或4℃過夜。

用TBST漂洗膜3次，每次10min。

后用TBS漂洗膜2次，每次10min。

八、固相免疫檢測

利用ECL（增強化學發光）發光檢測目的蛋白。

ECL試劑采用氧化還原反應的原理：

發光液A和B分別是魯米諾和過氧化氫，在辣根過氧化物酶（HRP）的催化作用下,魯米諾與過氧化氫反應生成一種過氧化物，過氧化物不穩定隨即分解，形成一種能發光的電子激發中間體,當后者由激發態返回至基態，就會產生熒光。

九、Western blot結果分析

目的蛋白的灰度值除以內參的灰度值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。

內參的選擇

內參即是內部參照，對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，一般要選擇一個在處理因素作用的條件下蛋白含量不會發生改變的蛋白作內參。

內參起著校正總蛋白上樣量的重要作用，只有在內參條帶基本均勻一致的情況下，目的蛋白條帶出現的差異才有意義,表明的確是實驗設計的干預因素造成目的蛋白量的變化，而不是加樣誤差造成目的條帶含量的變化。