Fish IF共染

Fish IF共染原位雜交原理：原位雜交是指將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進行。IF即免疫熒光，可檢測組織或細胞中某蛋白的表達情況及定位。

原位雜交(FISH、IF雙標)可以檢測靶基因與靶蛋白的共定位情況。

Fish IF共染實驗步驟

1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

2、脫水：組織固定完成后經梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。

3、切片：石蠟經切片機切片，攤片機撈片，62°烤箱烤片2h。

4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

5、消化：根據組織固定時間長短，切片于修復液中煮沸10-15分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據不同組織不同指標特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

6、預雜交：滴加預雜交液，37°C孵育1h。

7、雜交：傾去預雜交液，滴加含探針雜交液,恒溫箱37度雜交過夜。

8、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

9、孵育一抗：滴加一抗，PBS稀釋。4°過夜。后PBS洗3×5min。

10、孵育二抗：滴加相應二抗，室溫孵育50min。后PBS洗3×5min。

11、DAPI復染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。

12.鏡檢拍照：切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm,發藍光;FAM(488)綠光激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光;CY3紅光激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光。)

送樣運輸要求：

冰切。標本放原位雜交固定液中，常溫運輸;冰凍切片-20°運輸。

石蠟。標本放原位雜交固定液中，常溫運輸;石蠟切片常溫運輸。

細胞爬片。細胞爬片加原位雜交固定液固定15min后，密封，4度運輸。共聚焦皿

新鮮組織：組織取出后可以立即冷凍處理，后干冰運輸到武漢進行后續冰凍切片處理。新鮮組織-80°保存。

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